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Kurzbeschreibung:

 

2.1. Vorbereitung der SDE

Die Rhizome von SD wurden als getrocknetes Kraut von Hanherb Co. (Guri, Korea) bezogen. Die taxonomische Bestimmung des Pflanzenmaterials erfolgte durch Dr. Go-Ya Choi vom Koreanischen Institut für Orientalische Medizin (KIOM). Ein Belegexemplar (Nr. 2014 SDE-6) wurde im Koreanischen Herbarium für Standard-Heilpflanzen hinterlegt. 320 g getrocknete Rhizome von SD wurden zweimal mit 70%igem Ethanol extrahiert (2 h Rückfluss). Der Extrakt wurde anschließend unter reduziertem Druck eingeengt. Der Sud wurde filtriert, gefriergetrocknet und bei 4 °C gelagert. Die Ausbeute an Trockenextrakt aus dem Rohmaterial betrug 48,13 % (w/w).

 

2.2. Quantitative Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC)-Analyse

Die chromatographische Analyse erfolgte mit einem HPLC-System (Waters Co., Milford, MA, USA) und einem Photodiodenarray-Detektor. Für die HPLC-Analyse von SDE wurde die primäreO-Glucosylcimifugin-Standard wurde vom Korea Promotion Institute for Traditional Medicine Industry (Gyeongsan, Korea) bezogen, undsec-O-Glucosylhamaudol und 4′-O-β-D-Glucosyl-5-O-Methylvisamminol wurde in unserem Labor isoliert und durch Spektralanalysen, vorwiegend mittels NMR und MS, identifiziert.

SDE-Proben (0,1 mg) wurden in 70%igem Ethanol (10 ml) gelöst. Die chromatographische Trennung erfolgte mit einer XSelect HSS T3 C18-Säule (4,6 × 250 mm, 5 µm).μm, Waters Co., Milford, MA, USA). Die mobile Phase bestand aus Acetonitril (A) und 0,1%iger Essigsäure in Wasser (B) bei einer Flussrate von 1,0 ml/min. Es wurde ein mehrstufiges Gradientenprogramm verwendet: 5 % A (0 min), 5–20 % A (0–10 min), 20 % A (10–23 min) und 20–65 % A (23–40 min). Der Detektionsbereich wurde im Bereich von 210–400 nm gescannt und die Absorption bei 254 nm aufgezeichnet. Das Injektionsvolumen betrug 10,0 ml.μL. Standardlösungen zur Bestimmung von drei Chromonen wurden mit einer Endkonzentration von 7,781 mg/ml (prim-O-Glucosylcimifugin), 31,125 mg/ml (4′-O-β-D-Glucosyl-5-O-Methylvisamminol) und 31,125 mg/ml (sec-O-Glucosylhamaudol) in Methanol und bei 4°C aufbewahrt.

2.3. Bewertung der entzündungshemmenden AktivitätIn vitro

2.3.1. Zellkultur und Probenaufbereitung

RAW 264.7-Zellen wurden von der American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA) bezogen und in DMEM-Medium mit 1 % Antibiotika und 5,5 % FBS kultiviert. Die Zellen wurden in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO₂ bei 37 °C inkubiert. Zur Stimulation der Zellen wurde das Medium durch frisches DMEM-Medium ersetzt und Lipopolysaccharid (LPS, Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO, USA) in einer Konzentration von 1 M zugegeben.μg/mL wurde in Gegenwart oder Abwesenheit von SDE (200 oder 400) hinzugefügtμg/mL) für weitere 24 Stunden.

2.3.2. Bestimmung von Stickstoffmonoxid (NO), Prostaglandin E2 (PGE2), Tumornekrosefaktor-α(TNF-α), und Interleukin-6 (IL-6)-Produktion

Die Zellen wurden mit SDE behandelt und 24 Stunden lang mit LPS stimuliert. Die NO-Produktion wurde durch Messung des Nitritgehalts mit dem Griess-Reagenz gemäß einer früheren Studie analysiert [12Sekretion der entzündungsfördernden Zytokine PGE2, TNF-αIL-6 wurde mittels eines ELISA-Kits (R&D Systems) gemäß den Herstellerangaben bestimmt. Die Auswirkungen von SDE auf die NO- und Zytokinproduktion wurden bei 540 nm bzw. 450 nm mit einem Wallac EnVision-Spektrometer gemessen.™Mikroplattenlesegerät (PerkinElmer).

2.4. Bewertung der Aktivität gegen OsteoarthritisIn vivo

2.4.1. Tiere

Männliche Sprague-Dawley-Ratten (7 Wochen alt) wurden von Samtako Inc. (Osan, Korea) bezogen und unter kontrollierten Bedingungen mit einem 12-Stunden-Hell-Dunkel-Zyklus gehalten.°C und% relative Luftfeuchtigkeit. Die Ratten erhielten Standardfutter und Wasser.ad libitumAlle experimentellen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der National Institutes of Health (NIH) durchgeführt und vom Tierschutz- und Nutzungsausschuss der Universität Daejeon (Daejeon, Republik Korea) genehmigt.

2.4.2. Induktion von OA mit MIA bei Ratten

Die Tiere wurden vor Beginn der Studie nach dem Zufallsprinzip den Behandlungsgruppen zugeordnet (pro Gruppe). MIA-Lösung (3 mg/50μL einer 0,9%igen Kochsalzlösung wurde unter Narkose mit einer Mischung aus Ketamin und Xylazin direkt in den Gelenkspalt des rechten Knies injiziert. Die Ratten wurden randomisiert in vier Gruppen eingeteilt: (1) die Kochsalzgruppe ohne MIA-Injektion, (2) die MIA-Gruppe mit MIA-Injektion, (3) die SDE-behandelte Gruppe (200 mg/kg) mit MIA-Injektion und (4) die Indomethacin-(IM-)behandelte Gruppe (2 mg/kg) mit MIA-Injektion. SDE und IM wurden den Ratten eine Woche vor der MIA-Injektion über vier Wochen oral verabreicht. Die Dosierung von SDE und IM in dieser Studie verwendeten Werte basierten auf den in früheren Studien angewandten Dosierungen [10,13,14].

2.4.3. Messung der Gewichtsverteilung der Hinterpfoten

Nach der OA-Induktion war das ursprüngliche Gleichgewicht der Belastbarkeit der Hinterpfoten gestört. Ein Belastungstester (Linton Instrumentation, Norfolk, UK) wurde verwendet, um Veränderungen der Belastbarkeitstoleranz zu bewerten. Die Ratten wurden vorsichtig in die Messkammer gesetzt. Die von der Hinterpfote ausgeübte Belastungskraft wurde über einen Zeitraum von 3 Sekunden gemittelt. Das Gewichtsverteilungsverhältnis wurde mit folgender Gleichung berechnet: [Gewicht auf der rechten Hinterpfote / (Gewicht auf der rechten Hinterpfote + Gewicht auf der linken Hinterpfote)] × 100 [15].

2.4.4. Messung der Serum-Zytokinspiegel

Die Blutproben wurden 10 Minuten lang bei 1500 g und 4 °C zentrifugiert; anschließend wurde das Serum abgenommen und bis zur Verwendung bei −70 °C gelagert. Die IL-1-Konzentrationen wurden bestimmt.βIL-6, TNF-αDie PGE2-Konzentrationen im Serum wurden mit Hilfe von ELISA-Kits von R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen.

2.4.5. Quantitative Echtzeit-RT-PCR-Analyse

Die Gesamt-RNA wurde aus Kniegelenksgewebe mit TRI Reagent® (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) extrahiert, in cDNA umgeschrieben und mittels PCR mit dem One Step RT PCR Kit mit SYBR Green (Applied Biosystems, Grand Island, NY, USA) amplifiziert. Die quantitative Echtzeit-PCR wurde mit dem Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Grand Island, NY, USA) durchgeführt. Die Primersequenzen und die Sondensequenz sind in Tabelle 1 dargestellt.1Aliquots der cDNA-Proben und eine gleiche Menge GAPDH-cDNA wurden mit der TaqMan® Universal PCR Master Mixture, die DNA-Polymerase enthält, gemäß den Herstellerangaben (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) amplifiziert. Die PCR-Bedingungen waren: 2 min bei 50 °C, 10 min bei 94 °C, 15 s bei 95 °C und 1 min bei 60 °C über 40 Zyklen. Die Konzentration des Zielgens wurde mittels der vergleichenden Ct-Methode (Schwellenwertzyklus am Schnittpunkt der Amplifikationskurve mit dem Schwellenwert) gemäß den Herstellerangaben bestimmt.

FOB-Preis:0,50 – 9.999 US-Dollar / Stück

Mindestbestellmenge:100 Stück/Stücke

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